置百丈玄冰而崩裂,掷须臾池水而漂摇。

定量多色FISH检测儿童ETV6-RUNX1阳性急性淋巴细胞白血病的异质性及克隆演化

  定量多色FISH检测儿童ETV6-RUNX1阳性急性淋巴细胞白血病的异质性及克隆演化

  近年来,多项研究表明肿瘤细胞存在异质性[1,2,3,4]。急性淋巴细胞白血病(ALL)为血液系统的恶性肿瘤。Gawad等[4]在6例儿童ALL患者中进行了1 479个单细胞的全基因组测序,发现在同一患者体内,即使是在同一疾病时期,仍存在4 000种以上的白血病亚克隆,从而肯定了在ALL中存在巨大的克隆异质性的观点。因而,在ALL患儿中,肿瘤细胞存在异质性。

  Anderson等[5]对ETV6-RUNX1阳性ALL患儿进行单细胞水平研究,发现不同细胞内的基因改变并不一致,不同的亚克隆呈线状或树枝状演化。遗憾的是,Anderson等未对ETV6-RUNX1亚克隆状况与预后的相关性进行探讨。目前,在中国儿童ETV6-RUNX1阳性ALL中肿瘤细胞的异质性及克隆演化情况尚未见报道。为了解我国儿童ETV6-RUNX1阳性ALL中肿瘤细胞的异质性及克隆演化情况,探讨其与预后的相关性,我们应用单细胞定量多基因荧光原位杂交(quantitative multigene fluorescence in situ hybridization,QM-FISH)技术对2006年2月至2011年6月我院收治的48例初诊ETV6-RUNX1阳性ALL患儿进行回顾性研究,现报告如下。

  对象与方法

  1.对象:

  选取2006年2月至2011年6月我院收治的初诊住院ETV6-RUNX1阳性ALL患儿进行回顾性分析。共对48例ETV6-RUNX1阳性ALL患儿初诊骨髓标本进行QM-FISH检测,选取10名健康志愿儿童作为正常对照,取外周血进行QM-FISH检测。纳入本研究的患儿及正常儿童志愿者的监护人均签署知情同意书。本研究通过医院伦理委员会审批。

  2.治疗方案:

  2006年1月至2008年3月收治的患儿治疗方案参见文献[6]。2008年4月至2011年6月收治的患儿治疗方案参见文献[7]。

  3.QM-FISH:

  依据前期工作的结果,我们选用拷贝数改变频率最高的CDKN2A/2B、PAX5基因及对ALL预后影响较大的IKZF1基因参与组成基因探针组合。最终的基因探针组合包括ETV6(TEL)、RUNX1(AML1)、PAX5、P16(CDKN2A/2B)和IKZF1基因探针。TEL-AML1探针购自美国Vysis公司,其中RUNX1(AML1)基因使用红色荧光染料(符号R),ETV6(TEL)基因使用绿色荧光染料(符号G),产生的融合信号为黄色(符号F)。其余探针制作所选定的细菌人工染色体(BAC)克隆号见表1,依据文献[8]描述的步骤进行探针的制备、制片及图像采集工作。进行QM-FISH检测的每例患儿骨髓标本计数200个ETV6-RUNX1阳性的白血病细胞,每个细胞的统计内容包括:ETV6-RUNX1融合信号(F)、ETV6(G)、RUNX1(R)、PAX5(O)、CDKN2A/2B(P)和IKZF1(B)信号的个数。基因拷贝数改变的比例大于相应的cut-off值则为阳性。cut-off值的确定:正常人无ETV6-RUNX1融合信号,基因ETV6、RUNX1、PAX5、CDKN2A/2B和IKZF1均有2个等位基因信号,然而可能因为信号在空间结构上的重叠、扭转等造成融合基因、扩增、缺失等假阳性现象,计数10名正常对照标本中各种基因异常的比例并计算其均数(

  )与标准差(s),以

  +2s为cut-off值。基因拷贝数改变的cut-off值如表2所示。将信号表型完全相同的细胞称为一个亚克隆。阳性亚克隆是指所含基因拷贝数改变为阳性且比例>3%。

  表1PAX5、P16和IKZF1基因选定的细菌人工染色体克隆片段及标记

  表2定量多基因荧光原位杂交中各探针的cut-off值(%)4.随访:

  随访时间截止至2015年11月20日或失访日期(失访者),失访定义为病历中无记载病情转归或无法电话联系到患者。中位随访时间65.5(8~115)个月。无复发生存(RFS)期定义为自诊断到复发(包括分子生物学和临床复发)或末次随访日期。无事件生存(EFS)期定义为自诊断到第1次事故[包括分子生物学和临床复发、在完全缓解(CR)期间的死亡]或末次随访日期。无病生存(DFS)期指CR至白血病复发或在CR期间死亡或末次随访日期。总生存(OS)期指自诊断到死亡或末次随访日期。

  5.统计学处理:

  所有数据采用SPSS 16.0软件进行处理。非正态分布的计量资料用M(范围)表示,计数资料以例(%)表示。生存分析应用Kaplan-Meier生存曲线,Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

  结果

  1.一般资料:

  48例ETV6-RUNX1阳性的ALL患儿进行QM-FISH检测。其中男24例(50.0%)、女24例(50.0%),中位年龄4(1~13)岁。中位初诊WBC 9.35(1.75~239.80)×109/L,中位初诊PLT 51.5(9~294)×109/L。

  2.生存分析:

  48例患儿中,6例复发。2例复发后放弃治疗死亡,4例治疗缓解后再次复发死亡。5年RFS率为(87.4±4.8)%,EFS率为(85.4±5.1)%,DFS率为(85.4±5.1)%,OS率为(87.1±4.9)%。

  3.QM-FISH检测多个基因拷贝数变异及克隆演化分析:

  48例初诊ETV6-RUNX1阳性ALL患儿中,ETV6-RUNX1融合基因及ETV6、RUNX1和CDKN2A/2B基因检测到基因拷贝数的改变。2例融合信号增加;6例RUNX1信号减少,6例RUNX1信号增加;24例ETV6信号减少,1例ETV6信号增加;2例CDKN2A/2B信号减少。初诊时为1个克隆者34例(70.8%),2个克隆者9例(18.8%),≥3个克隆者5例(10.4%)。初诊患儿的各亚克隆之间呈线性或树枝状演化(举例见图1)。将患者按照白血病细胞的亚克隆数进行分组,1个克隆组、2个克隆组、≥3个克隆组患儿的5年DFS率分别为(85.3±6.1)%、100.0%、(60.0±21.9)%(P=0.116)(图2A);5年OS率分别为(81.4±8.3)%、100.0%、(80.0±17.9)%(P=0.469)(图2B)。各组患者间的预后差异无统计学意义。

  图1初诊患儿骨髓中白血病细胞的各亚克隆之间呈线性或树枝状演化

  图2依据白血病细胞的亚克隆数分组患者的无病生存(A)和总生存(B)曲线应用QM-FISH的方法对有初诊及复发时骨髓标本的3例患儿进行检测及比较,通过检测我们发现:例1第1次复发时的主要克隆与初诊时的主要克隆一致;例2和例3第1次复发时的克隆为克隆演化的新出现克隆(图3)。另外,还有1例患儿(例4)仅有第3次复发时的骨髓细胞标本并进行了QM-FISH检测,由图4可见,例4患儿复发时有ETV6、RUNX1、IKZF1基因拷贝数的增加,CDKN2A/2B基因拷贝数的缺失。同时存在多个亚克隆,且各亚克隆之间存在演化情况。例4患儿初诊时的骨髓应用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术检测,结果表明:该患儿存在ETV6和PAX5基因拷贝数的增加,而CDKN2A/B与IKZF1基因的拷贝数无变化。因而,可以推测出例4第3次复发时的克隆为克隆演化的新出现克隆。4例患儿的临床特征与预后的情况详见表3,复发克隆为新出现克隆的患儿(例2、3、4)再次缓解时间短,甚至不缓解,最终均死亡。

  图33例患儿初诊及复发时骨髓标本的定量多基因荧光原位杂交检测结果

  图4例4患儿第3次复发时骨髓标本的定量多基因荧光原位杂交检测结果

  表34例复发ETV6-RUNX1阳性急性淋巴细胞白血病患儿临床特征及转归讨论

  Nowell等[2]认为白血病起源于获得了始动基因异常的单个异常细胞,后代细胞获得额外的突变后在克隆选择的压力下最终发展成为白血病。因而,克隆异质性是克隆选择的首要条件。Mitelman数据库中记载着ALL中染色体畸变的数据,其中84.0%的患者只有1个克隆,14.0%的患者含有2个亚克隆,2.3%的患者含有3个亚克隆,0.4%的患者含有4个及4个以上亚克隆[9]。与其结果类似,我们的结果显示70.8%的ETV6-RUNX1阳性ALL患者初诊时含有1个克隆,18.8%的患者含有2个克隆,10.4%的患者含有3个或3个以上克隆。

  同一患者体内的肿瘤细胞存在克隆演化的情况。克隆演化在疾病的早期阶段已经存在,这些亚克隆在存活、增殖及治疗耐药等方面的能力存在差异,并且可能相互竞争。当治疗开始后,治疗的压力会加入到亚克隆竞争选择中去,那些对药物敏感的亚克隆会被清除,而耐药克隆得以存活,最终导致复发。ALL中这种克隆演化及对化疗的反应已得到证实[10,11]。Anderson等[5]对ETV6-RUNX1阳性ALL患者进行QM-FISH检测,发现不同细胞的基因改变并不一致,不同的亚克隆呈线状或树枝状演化。患儿复发时的克隆可能为初诊时的克隆,亦可能为新出现的克隆。此外,有研究表明,B-ALL的复发常与在一些基因(如CREBBP、NT5C2、SETD2等)中获得耐药的突变有关[12,13,14]。我们对48例ETV6-RUNX1阳性ALL患儿进行检测,并依据人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016版)中对于干系、旁系克隆定义及ETV6-RUNX1阳性的标准信号,进行克隆演化的顺序推测。我们发现,患儿的肿瘤细胞存在克隆演化情况,各亚克隆之间呈线性或树枝状演化。我们对3例复发患者应用第1次复发时的骨髓标本与初诊时的骨髓标本进行QM-FISH检测,另外对1例患儿第3次复发的骨髓标本进行QM-FISH检测,并与初诊时MLPA检测结果进行比较。发现ETV6-RUNX1阳性ALL患儿的复发可能来源于初诊时的克隆,亦有可能来源于新的克隆。从4例复发患儿的转归来看,第1次复发克隆为新出现克隆的患儿再次缓解持续的时间短,甚至出现不缓解的情况。我们推测,其原因可能为在化疗药物的治疗选择下,出现的新克隆的恶性程度更高或为耐药亚克隆。此外,例1在第2次复发后再化疗不能缓解,亦可能与复发时出现了新的克隆有关。遗憾的是第2次复发未能进行QM-FISH检测。Bashford-Rogers等[15]也认为,获得耐药突变后肿瘤细胞可能发生耐药,从而导致治疗强度不够。因而,我们认为对于复发克隆为新出现克隆的情况,应在缓解后尽快采取干细胞移植等更强的治疗,以改善预后。遗憾的是,我们仅仅能通过3个基因的拷贝数变化来推测存在克隆演化情况,无法得知对于耐药基因等其他更多基因可能改变的情况,需要进一步的深入研究来证实。

  由于染色体FISH技术的特点,可能存在荧光信号在空间结构上的重叠、扭转等,会有假阳性的可能。为避免假阳性,需设定cut-off值,因而不能区分出比例极小的亚克隆的存在。发现比例极小的亚克隆,需要采用更精确的实验方法来实现。

  总之,我国儿童ETV6-RUNX1阳性ALL肿瘤细胞存在异质性,不同的亚克隆呈线状或树枝状演化。ETV6-RUNX1阳性ALL患儿复发时的主要克隆可能为初诊时的主要克隆,亦可能为新出现的克隆。QM-FISH技术有助于研究白血病细胞的克隆演化,推测复发的根源,对于复发患者的预后判断可能有一定的提示作用。对于复发克隆为新出现克隆的患儿建议尽早采取更强的治疗方案,以改善预后。


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